Тест, который обнаруживает варианты COVID-19 в вашем слюне

07.08.2021                                           от Комментариев нет

Поскольку вариант Дельты наносит ущерб непривитому населению, а число случаев заболевания COVID-19 растет по всему миру, пандемия еще далека от завершения. Несмотря на впечатляюще быстрое развитие диагностических тестов SARS-CoV-2 за последние полтора года, подавляющее большинство образцов пациентов по-прежнему необходимо отправлять в лабораторию для обработки, что замедляет темпы отслеживания случаев COVID-19. Если образец должен быть протестирован на определенный вариант вируса, он должен быть генетически секвенирован, что требует еще больше времени и ресурсов.

Теперь исследователи из Института биологической инженерии Висса при Гарвардском университете, Массачусетского технологического института (MIT) и нескольких больниц Бостона создали недорогой диагностический тест на основе CRISPR, который позволяет пользователям проверять себя на наличие SARS-CoV-2 и нескольких вариантов вируса, используя образец своей слюны дома, без необходимости в дополнительных инструментах.

Диагностическое устройство, называемое минимально инструментальным ШЕРЛОКОМ (miSHERLOCK), простое в использовании и предоставляет результаты, которые могут быть прочитаны и проверены приложением для смартфона в течение одного часа. Он успешно различал три различных варианта SARS-CoV-2 в экспериментах и может быть быстро перенастроен для обнаружения дополнительных вариантов, таких как Delta. Устройство может быть собрано с помощью 3D-принтера и общедоступных компонентов примерно за 15 долларов, а повторное использование оборудования снижает стоимость отдельных анализов до 6 долларов каждый.

“miSHERLOCK устраняет необходимость в транспортировке образцов пациентов в централизованное место тестирования и значительно упрощает этапы подготовки образцов, предоставляя пациентам и врачам более быструю и точную картину индивидуального и общественного здоровья, что имеет решающее значение во время развивающейся пандемии”,-сказала соавтор Хелена де Пуиг, доктор философии, аспирант Института Висса и Массачусетского технологического института.

Диагностическое устройство описано в статье, опубликованной сегодня в журнале Science Advances.

От цепочки поставок до ШЕРЛОКА

Будучи инструктором по педиатрии в Бостонской детской больнице со специализацией в области инфекционных заболеваний, соавтор Роуз Ли, доктор медицинских наук, уже более года работает на переднем крае пандемии COVID-19. Ее опыт работы в клинике послужил вдохновением для проекта, который в конечном итоге стал miSHERLOCK.

“Простые вещи, которые раньше были повсеместно распространены в больнице, такие как мазки из носоглотки, внезапно стало трудно достать, поэтому были нарушены обычные процедуры обработки образцов, что является большой проблемой в условиях пандемии”, – сказал Ли, который также является приглашенным научным сотрудником Института Висса. “Мотивацией нашей команды для этого проекта было устранение этих узких мест и обеспечение точной диагностики COVID-19 с меньшей зависимостью от глобальных цепочек поставок, а также возможность точного выявления вариантов, которые начинали появляться”.

Процедура диагностики требует только, чтобы пользователь плюнул в камеру подготовки образцов, а затем перенес накопительный диск в реакционную камеру и нажал на поршень, который активирует реакцию и сводит к минимуму риск перекрестного загрязнения. Кредит: Институт Висса при Гарвардском университете
Для обнаружения SARS-CoV-2 в своей диагностике группа обратилась к технологии на основе CRISPR, созданной в лаборатории преподавателя Wyss Core и старшего автора статьи Джима Коллинза, доктора философии, под названием “специфическая высокочувствительная ферментативная репортерная разблокировка” (ШЕРЛОК). ШЕРЛОК использует “молекулярные ножницы” CRISPR для разрезания ДНК или РНК в определенных местах с дополнительным бонусом: этот особый тип ножниц также разрезает другие фрагменты ДНК в окружающей области, позволяя создавать их с помощью молекул-зондов нуклеиновых кислот для получения сигнала, указывающего на то, что цель была успешно разрезана.

Исследователи создали реакцию ШЕРЛОКА, предназначенную для разрезания РНК SARS-CoV-2 в определенной области гена, называемого нуклеопротеином, который сохраняется в нескольких вариантах вируса. Когда молекулярные ножницы—фермент под названием Cas12a—успешно связываются с геном нуклеопротеина и разрезают его, одноцепочечные ДНК-зонды также разрезаются, производя флуоресцентный сигнал. Они также создали дополнительные анализы ШЕРЛОКА, предназначенные для выявления группы вирусных мутаций в последовательностях спайковых белков, которые представляют три генетических варианта SARS-CoV-2: Альфа, Бета и Гамма.

Вооружившись анализами, которые могли бы надежно обнаруживать вирусную РНК в допустимом диапазоне концентраций для диагностических тестов, разрешенных FDA, команда затем сосредоточила свои усилия на решении, возможно, самой сложной задачи в диагностике: подготовке образцов.

Плюнь, подожди, просканируй

“Когда вы тестируете образец на наличие нуклеиновых кислот [таких как ДНК или РНК], вам нужно выполнить множество шагов, чтобы подготовить образец, чтобы вы могли фактически извлечь и амплифицировать эти нуклеиновые кислоты. Вы должны защитить образец, пока он находится в пути в испытательный центр, а также убедиться, что он не заразен, если вы имеете дело с инфекционным заболеванием. Чтобы сделать этот диагностический тест действительно простым в использовании, нам было важно максимально упростить его”,-сказал соавтор Сяо Тан, доктор медицинских наук, доктор философии, клинический сотрудник Института Висса и преподаватель медицины в области гастроэнтерологии в Массачусетской больнице общего профиля.

Команда решила использовать в качестве метода сбора образцы слюны, а не мазки из носоглотки, потому что пользователям проще собирать слюну, и исследования показали, что SARS-CoV-2 обнаруживается в слюне в течение большего количества дней после заражения. Но необработанная слюна сама по себе представляет проблемы: она содержит ферменты, которые разлагают различные молекулы, вызывая высокий процент ложных срабатываний.

Исследователи разработали новую методику для решения этой проблемы. Сначала они добавили в слюну два химических вещества, называемых DTT и EGTA, и нагрели образец до 95°C в течение 3 минут, что устранило ложноположительный сигнал из необработанной слюны и разрезало любые вирусные частицы. Затем они включили пористую мембрану, которая была разработана для улавливания РНК на ее поверхности, которую, наконец, можно было добавить непосредственно в реакцию ШЕРЛОКА, чтобы получить результат.

Чтобы интегрировать подготовку образца слюны и реакцию ШЕРЛОКА в одну диагностику, команда разработала простое устройство на батарейках с двумя камерами: камерой для подготовки образца с подогревом и неотапливаемой реакционной камерой. Пользователь плюет в камеру для подготовки образцов, включает нагрев и ждет от трех до шести минут, пока слюна попадет в фильтр. Пользователь удаляет фильтр и переносит его в колонну реакционной камеры, затем нажимает плунжер, который помещает фильтр в камеру и прокалывает резервуар для воды, чтобы активировать реакцию ШЕРЛОКА. 55 минут спустя пользователь смотрит через тонированное окно трансиллюминатора в реакционную камеру и подтверждает наличие флуоресцентного сигнала. Они также могут использовать сопутствующее приложение для смартфона, которое анализирует пиксели, регистрируемые камерой смартфона, чтобы обеспечить четкий положительный или отрицательный диагноз.

Прилагаемое приложение для смартфона анализирует флуоресцентные показания, полученные в результате анализа, давая пользователям четкий “Положительный” или “Отрицательный” результат. Результаты также могут быть переданы врачам и организациям здравоохранения для отслеживания распространения заболевания. Кредит: Институт Висса при Гарвардском университете
Исследователи протестировали свое диагностическое устройство, используя клинические образцы слюны 27 пациентов с COVID-19 и 21 здорового пациента, и обнаружили, что Мишерлок правильно идентифицировал COVID-19-положительных пациентов в 96% случаев и пациентов без заболевания в 95% случаев. Они также проверили его эффективность против Альфа -, Бета-и гамма-вариантов SARS-CoV-2, добавив в слюну здорового человека синтетическую вирусную РНК полной длины, содержащую мутации, представляющие каждый вариант, и обнаружили, что устройство эффективно в диапазоне концентраций вирусной РНК.

“Одна из замечательных особенностей miSHERLOCK заключается в том, что он полностью модульный. Само устройство отделено от анализов, поэтому вы можете подключать различные анализы для определенной последовательности РНК или ДНК, которую вы пытаетесь обнаружить”,-сказала соавтор первого автора Девора Наджар, научный сотрудник MIT Media Lab и лаборатории Коллинза. “Устройство стоит около 15 долларов, но массовое производство снизит стоимость корпуса примерно до 3 долларов. Анализы для новых целей могут быть созданы примерно за две недели, что позволит быстро разработать тесты для новых вариантов COVID-19 и других заболеваний”.

Готов к реальному миру

Команда miSHERLOCK создала свое устройство с учетом параметров с низким уровнем ресурсов, поскольку пандемия выявила огромное неравенство в доступе к медицинской помощи, существующее между различными частями мира. Аппаратное обеспечение устройства может быть создано любым человеком, имеющим доступ к 3D-принтеру, а файлы и схемы схем доступны в открытом доступе в Интернете. Добавление приложения для смартфона также было направлено на настройки с ограниченными ресурсами, поскольку услуга мобильной связи доступна практически в любой точке мира, даже в районах, до которых трудно добраться пешком. Команда стремится работать с производителями, которые заинтересованы в производстве miSHERLOCK в масштабе для глобального распространения.

“Когда начался проект Мишерлока, мониторинг вариантов SARS-CoV-2 практически не проводился. Мы знали, что отслеживание вариантов будет невероятно важно при оценке долгосрочных последствий COVID-19 для местных и глобальных сообществ, поэтому мы подтолкнули себя к созданию действительно децентрализованной, гибкой, удобной для пользователя диагностической платформы”,-сказал Коллинз, который также является профессором медицинской инженерии и науки Termeer в Массачусетском технологическом институте. “Решив проблему подготовки образцов, мы обеспечили, чтобы это устройство было практически готово к использованию потребителями как есть, и мы рады сотрудничать с промышленными партнерами, чтобы сделать его коммерчески доступным”.

Форма добавления комментария

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *